Wyróżniamy trzech bossów głównych:
- Satan
- Isaac (boss)
- ??? (boss)
Każdy z tych bossów ma trzy fazy:
- Faza pierwsza - boss jest w najsłabszej formie (nikt z bossów nic nie respi, prócz ???)
- Faza druga - boss staje się silniejszy, można to zauważyć, po cechach wyglądu i ataku (np. podkrawione oczy, strumienie światła i laser z ust)
- Faza trzecia - każdy z bossów respi potwory i atakuje szybciej i liczniejszymi salwami.
Ciekawosta : Każdy z bossów, podczas fazy ostatecznej jest w powietrzu .